ملخص رسالة دكتوراه: إعادة التمايز والتحول الوراثي للاستيفيا

ملخص الرسالة

إعادة التمايز والتحول الوراثي للاستيفيا

Regeneration and Genetic Transformation in Stevia rebaudiana

ملخص الرسالة:

يعتبر محصول الاستيفيا من المحاصيل الجديدة بمصر، وخاصة بمحافظة شمال سيناء ويواجه هذا المحصول بعض المشكلات يجب التغلب عليها لنشره على نطاق واسع حتى يصبح محصولا اقتصاديا مثل القصب والبنجر ومن ضمن هذه المشكلات إكثار النبات حيث أن نسبة إنبات البذور تتراوح ما بين 10-20% وكذلك عدم القدرة على تحمل الظروف البيئية الغير ملائمة مثل الملوحة والجفاف وتعتبر الطرق الحديثة لزراعة الأنسجة وإعادة التكشف واستخدام أسلوب النقل الجيني من التقنيات المفيدة لإكساب الصفات المرغوبة للنباتات بهدف التحسين. وقبل إحداث عملية التحسين عن طريق النقل الجيني فقد كان لا بد في البداية من وضع وتثبيت انظمة فعالة لعملية إعادة التكشف و النقل الجيني وللنبات أهميه طبية في علاج كثير من الأمراض المنتشرة ومنها مرض السكر وضغط الدم المرتفع وموسع للأوعية الدموية فهو مفيد لمرضى القلب والأورام الذي أثبتت الأبحاث والتجارب التطبيقية فوائده العديدة للمرضى والأصحاء على حد سواء.

نبات ‏ ‏الاستيفيا‏ ‏في‏ ‏الاستخدامات‏ ‏الطبية‏:‏
‏ ‏1- يستخدم‏ ‏كنظام‏ ‏غذائي‏ ‏لأي‏ ‏شخص‏ ‏يعاني‏ ‏من‏ ‏مشاكل‏ ‏في‏ ‏سكر‏ ‏الدم‏.‏

‏2- يساعد‏ ‏على‏ ‏تقوية‏ ‏الهضم‏.‏

‏ ‏3- يستخدم‏ ‏كعلاج‏ ‏طبيعي‏ ‏للإنفلونزا‏ ‏ونزلات‏ ‏البرد‏ ‏واحتقان‏ ‏الحلق‏.‏

‏ ‏4- لها‏ ‏تأثير‏ ‏على‏ ‏تقوية‏ ‏عضلة‏ ‏القلب‏ ‏والأوعية‏ ‏الدموية‏.‏

‏ ‏5- يستخدم‏ ‏في‏ ‏علاج‏ ‏الأمراض‏ ‏الجلدية‏ ‏حيث‏ ‏أنها‏ ‏ذات‏ ‏تأثير‏ ‏فعال‏ ‏علي‏ ‏إكزيما‏ ‏والتهاب‏ ‏الجلد‏.‏

‏ ‏6- يساعد‏ ‏علي‏ ‏تجنب‏ ‏حدوث‏ ‏تسوس‏ ‏الأسنان‏ ‏وعلاج‏ ‏أمراض‏ ‏اللثة‏ ‏كما‏ ‏أنها‏ ‏تمنع‏ ‏تكوين‏ ‏الجير‏ ‏علي‏ ‏الأسنان‏.

‏
‏ ‏7- يتمتع‏ نبات‏ ‏الاستيفيا‏ ‏بالقدرة‏ ‏على‏ ‏منع‏ ‏نمو‏ ‏وتكاثر‏ ‏بعض‏ ‏البكتريا‏ ‏والكائنات‏ ‏الحية‏ ‏الدقيقة‏ ‏الممرضة‏ ‏يوضح‏ ‏أهمية‏ ‏استخدام‏ ‏النبات ‏ ‏في‏ ‏منتجات‏ ‏معاجين‏ ‏الأسنان‏ ‏وغسول‏ ‏الفم‏.‏

8- يستخدم للمساعدة في أنظمة الرجيم الغذائي، وللحد من الحموضة الزائدة في المعدة، وللتخلص من حمض البوليك الزائد في الجسم.

وأجريت هذه الدراسة في معمل زراعة الانسجة بكلية العلوم الزراعية البيئية بالعريش - جامعة قناة السويس ومعهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية التابع لمركز البحوث الزراعية بالجيزة - خلال الفترة من 2009-2012 وكانت الأهداف الرئيسية من الدراسة هي: إعادة التمايز والتحول الوراثي باستخدام نظامي قاذفة الجينات لتطوير نبات الاستيفيا باستخدام الهندسة الوراثية وكان الهدف تحديد الظروف المثلي للتحول الوراثي والتمايز لنبات الاستيفا صنف اسبنتا لإنتاج نباتات معدلة وراثيا باستخدام جين bar لمقاومة مبيد الحشائش وكذلك جين  gus الذي يعطي دليل لوني باستخدام تقنية قاذف الجينات وذلك باستخدام بلازميد pCGP1258 و بناءا عليه فقد استهدفت الدراسة تأسيس نظام ثابت لإعادة التكشف (Regeneration) بإستخدام أسلوب التكشف الجنينى غير المباشر  والتحول الوراثى (Transformation) لصنف الاستيفيا اسبنتا, كما تم وضع نظام يعتمد علية لنقل الجينات (bar and Gus genes) و ذلك بهدف الحصول على نباتات الاستيفيا معدلة التركيب الوراثي مستخدما في ذلك طريقه جهاز الدفع المباشر Biolistic gene gun لإحداث عملية النقل الجيني.

ويمكن تلخيص النتائج فيما يلي:
1- استحداث الكالس:

استخدام بيئة الزراعة التي تحتوي علي تركيز 3,4 ,5ملجم /لتر 2,4 )2,4-D داي كلورا فينوكسي حامض الخليك )اعطت افضل كالس مقارنة بالبيئة التي تحتوي علي 2 ملجم /لتر.

2- درجة الحساسية والتحمل لمبيد الحشائش:

التركيز 3 ملجم/لتر من مبيد الحشائش تأثير مميت علي الكالس بينما كانت نسبة البقاء في التركيزات المنخفضة عالية.

3- مرحلة التأسيس والتضاعف:

أ- عدد الأفرع:

أعطت القمة النامية اعلي عدد من الأفرع مقارنة بالبراعم الجانبية.

ب- طول الفرع:

أظهر اطول فرع عند تركيز 5.1 من البنزيل ادنين وكذلك التفاعل بين الجزء النباتي البرعم الجانبي والتركيز5.1 من البنزيل ادنين.

ج- عدد العقد:

أعطت القمة النامية أكبر عدد من العقد مقارنة بالبرعم الجانبي عند تركيز 5.1 من البنزيل ادنين أعطى التركيز 5.1 من البنزيل ادنين أفضل النتائج لكلا الأجزاء النباتية المستخدمة أظهر التفاعل بين البرعم الجانبي وتركيز 5.1 من البنزيل ادنين أفضل عدد من العقد.

د- عدد الاوراق:

أعطت القمة النامية أكبر عدد من الأوراق مقارنة بالبرعم الجانبي عند تركيز 5.1 من البنزيل ادنين أعطى التركيز 5.1 من البنزيل ادنين أفضل النتائج لكلا الأجزاء النباتية المستخدمة أظهر التفاعل بين البرعم الجانبي وتركيز 5.1 من البنزيل ادنين أفضل عدد من الأوراق.

2- مرحلة التجذير:

1- تأثير نوع الأوكسين وتركيزه علي الاستيفيا.

أ- عدد الجذور:

كان أكبر عدد للجذور عند استخدام اندول حامض البيوتريك مقارنة بنفتالين حمض الخليك.

وكذلك عند استخدام اندول حامض البيوتريك بتركيز 3 ملجم/لتر.

ب- طول الجذور:

ظهرت أطول جذور عند استخدام اندول حامض البيوتريك مقارنة بنفتالين حمض الخليك.

وكذلك عند التفاعل بين اندول حامض البيوتريك و تركيز 3 ملجم/لتر.

2- تأثير قوة البيئة وتركيزات الاندول حامض البيوتيريك:-

أ- عدد الجذور:

أعطت البيئة الكاملة أعلي عدد من الجذور مقارنة بنصف قوة البيئة وأيضا تركيز الأوكسين 1.5 ملجم / لتر كان الأفضل. بينما أعلى عدد من الجذور ظهر عند التفاعل بين البيئة الكاملة والتركيز 1.5 ملجم/لتر.

ب- طول الجذور:

أعطت البيئة الكاملة أطول جذور مقارنة بالنصف قوة من البيئة وأيضا التركيز 1.5 ملجم/لتر كان الأفضل. وكان أعلى عدد من الجذور عند التفاعل بين تركيز 1ملجم حمض الاندول بيوتيريك والبيئة الكاملة.

2- اجهاد الملوحة والجفاف:

تهدف هذه التجربة إلى تقييم نبات الاستيفيا ريبوديانا تحت ظروف الإجهاد. النبيتات زرعت بيئة الزراعة المعدلة والمضاف إليها تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم هي (صفر. 5000-7500-10000) جزء في المليون كظروف للإجهاد. وكذلك المانتيول بتراكيزات (صفر. 5-7.5-10) بار. النتائج أظهرت ان نمو النبيتات يقل عند زيادة كلا من مستويات الملوحة والجفاف،وصفات نمو النبيتات كانت معنوية تحت المستويات المختلفة. إجهاد الجفاف كان أكثر تأثيرا من اجهاد الملوحة علي كل الصفات.أعلى معدل لصفات النمو للنبيتات ظهر عند تركيز 5000 جزء في المليون من الملوحة بينما أقل معدل ظهر عند تركيز 10 بار من الإجهاد. بعض المعاملات تبشر بتحمل الاستيفيا للملوحة والجفاف تحت ظروف الإجهاد.

3- التحول الوراثي باستخدام قاذفة الجينات:

تم إجراء التحول الوراثي للاستيفيا باستخدام قاذفة الجينات لإدخال البلازميد pCGP1258 والذي يحتوي علي جيني الـ  gus و bar لمقاومة مبيدات الحشائش إلى الكالس من الاستيفيا باستخدام قوة الضغط 900 و 1100 لإدخال حبيبات الذهب ذات قطر 1 µm بالقذف مرة واحده لإجراء عملية التحول الوراثي. وكانت نسبة كفاءة التحول الوراثي لقوة الضغط 900 هي 3.3 % و 8.3 % لقوة الضغط 1100.

4- اختبار النباتات المحولة وراثياً:

تم التأكد من دخول جيني - gus والـ bar في جينوم النباتات المحولة وراثيا عن طريق التفاعل المتسلسل للبوليمرات (PCR) حيث أثبتت النتائج وجود الحزم الخاصة بالجينات عند الوزن الجزيئي الخاص به.